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大分子互作仪
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Ligandtracer应用

蛋白质是生命功能的主要执行者,许多蛋白质的功能发挥是通过蛋白质相互作用实现的。人类细胞中约有7000种蛋白质,其中30%在细胞膜上,

控制细胞分子运作机制的信号有60%-70%由这些膜蛋白产生,但膜蛋白很难提纯,现有的检测大多是将膜蛋白从其所处环境中分离,这些方法不仅昂贵耗时,

还可能会影响目标膜蛋白的功能。此外,蛋白互作是非共价结合的动态过程,有相互作用往往很弱,不易检测到,甚至有些蛋白结合或解离的时间很短,使常规的检测方法受限。

亲和力是生物分子反应达到平衡(稳态)时的理论,它反映结合的强度。动力学是研究分子间是怎样相互作用并达到稳态的,反映结合的快慢。有些配体受体互作有相同的亲和力

却显示不同的动力学。这些动力学相关的信息在新药筛选方面会更加有用,例如要求效果快速的安眠药就必须是快速与受体结合,而要求药效时间长的止痛药则需要解离慢且与受体结合时间长久。

LigandTracer为科学家提供了一个无需分离膜蛋白、在细胞水平上即可检测蛋白功能的平台,此外它还能在组织或蛋白水平检测靶蛋白质和其他多种生物分子之间的相互作用,并进行实时动力学和亲和力研究。

LigandTracer是全球首个可以实时定量蛋白细胞互作的系统,也是首个实现定
量细胞表面受体数量的系统。

LigandTracer系统应用于配基-受体的相互作用、抗原-抗体相互作用的免疫学、蛋白质组学、医学诊断、药物研发和筛选、疾病治疗等研究,

涵盖了蛋白-蛋白互作、蛋白-细胞/组织切片互作、病毒-细胞互作、药物分子-细胞互作、细菌-细胞的结合。
﹡动力学分析:抗体特异性、抗体与细胞的亲和力、抗体的亲和-解离速率(Kd常数)、抗体的结合浓度
﹡细胞表面受体定量
﹡抗体评价:亲和力及特异性测定
﹡药物研发:EC50、Emax,细胞周期研究中同步化的检测(同位素标记)
﹡疾病治疗:癌分子靶向治疗药物疗效监测,抗辐射条件下DNA的合成与修复

Ligandtracer功能

亲和力和动力学测定

LigandTracer可以实时检测蛋白互作过程,因此即使对有相同的亲和力但结合解离不同的动力学过程也能捕获准确信息。

通过比较不同浓度标记蛋白的信号峰值可计算细胞和蛋白相互作用的亲和力大小。另外通过吸附与截留实验,可以检测蛋白结合解离过程,得到其动力学参数。

三种不同浓度标记配体与受体结合,平滑曲线代表了与之匹配的互作类型

高亲和力结合的孵育时间的确定

对于高亲和力抗体尤其一些治疗药物如 KD <1 nM,常规方法所用孵育时间往往达不到假定的反应平衡而导致结果不准确。

而LigandTracer实时捕获结合解离信息,不再依赖于反应达到平衡,大大降低了实验的盲目性和不确定性,避免了错误的实验结果。

LT Green检测FITC标记pertuzumab与SKOV3细胞HER2受体结合,Alexa Fluor ® 488标记cetuximab 与U343细胞EGFR结合。

结果:即使抗体浓度达到4.4 nM,远高于其相应KD,反应达到平衡均超过20h。这二种抗原抗体的结合均表现出极高的亲和力,如果仅单独研究亲和力无法获知反应达到平衡的时间。

Antibody-antigen interactions: What is the required time to equilibrium?Andersson K etc., Nature Preceedings (2010) 

LigandTracer Green

荧光标记检测,对FITC标记的化合物或其它具有相同激发波长和发射波长的荧光标记物进行实时观察。

可选择的检测器:

*蓝色(488nm)-绿色(535nm)FITC和其它类似荧光标记

*黄色(590nm)-红色(632nm)TexasRed和其它类似荧光标记

*红色(632nm)-近红外(670nm)Alexa Fluor和其它类似荧光标记

 

应用

相同的亲和力,不同的动力学

亲和力是生物分子反应达到平衡(稳态)时的理论,它反映结合的强度。动力学是研究分子间是怎样相互作用并达到稳态的,反映结合的快慢。

LigandTracer实时反映动力学互作全过程,相同的亲和力,却有二种不同结合解离的动力学过程。这是传统终点饱和法无法获知的。

对于fast on- fast off类型的蛋白互作来说,它可能在短时间内即达到平衡后不久开始解离,但若孵育时间长可能会在洗脱过程之前就开始解离、当洗脱后可能已全部解离,

终点法测定会误以为根本没有结合;而对slow on- slow off类型来说,为达到动态平衡往往需要数小时甚至数天,但因曲线趋势变化很微弱,

往往会被误以为已经达到平衡;如果单独靠进一步延长孵育时间,又存在抗体蛋白被细胞代谢掉的危险,从而结果也不准确。

这些动力学相关的信息在新药筛选方面会更加有用,例如要求效果快速的安眠药就必须是快速与受体结合,而要求药效时间长的止痛药则需要解离慢且与受体结合时间长久。

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